हॉटस्टार्ट टैक डीएनए पोलीमरेज़
हॉट स्टार्ट टैक डीएनए पॉलीमरेज़ (एंटीबॉडी संशोधन) थर्मस एक्वाटिकस YT-1 से एक हॉट-स्टार्ट थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलीमरेज़ है, जिसमें 5'→3' पॉलीमरेज़ गतिविधि और 5´ फ्लैप एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि होती है।हॉट-स्टार्ट टाक डीएनए पोलीमरेज़ एक टाक डीएनए पोलीमरेज़ है जो थर्मोलैबाइल टाक एंटीबॉडी द्वारा संशोधित होता है।एंटीबॉडी संशोधन से पीसीआर की विशिष्टता, संवेदनशीलता और उपज में वृद्धि हुई।
अवयव
| अवयव | HC1012ए-01 | HC1012ए-02 | HC1012ए-03 | HC1012ए-04 |
| 5×एचसी टैक बफर | 4×1 एमएल | 4×10 एमएल | 4×50 एमएल | 5×400 एमएल |
| हॉट स्टार्ट टैक डीएनए पोलीमरेज़ (एंटीबॉडी संशोधित) (5 यू/μL) | 0.1 एमएल | 1 एमएल | 5 एमएल | 10×5 एमएल |
अनुप्रयोग
10 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.4 25℃ पर), 100 एमएम केसीएल, 0.1 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम डाइथियोथेरिटॉल, 0.5% ट्वेन20, 0.5% आईजीईपीएएलसीए-630 और 50% ग्लिसरॉल।
गोदाम की स्थिति
0°C के तहत परिवहन और -25°C~-15°C पर भंडारण किया जाए।
इकाई परिभाषा
एक इकाई को एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है जो 75 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट में एसिड अघुलनशील सामग्री में 15 एनएमओएल डीएनटीपी को शामिल करता है।
गुणवत्ता नियंत्रण
1.Endओन्यूक्लिज़ गतिविधि:37℃ पर 4 घंटे के लिए 4 μg pUC19 डीएनए के साथ 20 यू एंजाइम के ऊष्मायन के परिणामस्वरूप जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित डीएनए का कोई पता लगाने योग्य क्षरण नहीं हुआ।
2.5 केबी लैम्ब्डा पीसीआर:200 µM dNTPs और 0.2 µM प्राइमर की उपस्थिति में Taq DNA पोलीमरेज़ की 1.25 इकाइयों के साथ 5 एनजी लैम्ब्डा डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के 25 चक्रों के परिणामस्वरूप अपेक्षित 5 केबी उत्पाद प्राप्त होता है।
3.एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि:37℃ पर 30 मिनट के लिए 10 एनएमओएल 5´-एफएएम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ न्यूनतम 12.5 यू टैक डीएनए पॉलीमरेज़ युक्त 50 μl प्रतिक्रिया का ऊष्मायन कोई पता लगाने योग्य गिरावट नहीं देता है।
4.RNase गतिविधि:37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1μg आरएनए प्रतिलेख के साथ 20 यू एंजाइम युक्त 10 μL प्रतिक्रिया के ऊष्मायन के परिणामस्वरूप जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित आरएनए का कोई पता लगाने योग्य क्षरण नहीं हुआ।
5.ताप निष्क्रियता:नहीं।
प्रतिक्रिया प्रणाली
| अवयव | आयतन |
| टेम्पलेट डीएनएa | वैकल्पिक |
| 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर | 0.5 μL |
| 10 μM रिवर्स प्राइमर | 0.5 μL |
| dNTP मिक्स (प्रत्येक 10mM) | 0.5 μL |
| 5×एचसी टैक बफर | 5 μL |
| टाक डीएनए पोलीमरेज़बी(5यू/μL) | 0.125 μL |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | 25 μL तक |
टिप्पणियाँ:
1)ए.
| डीएनए | मात्रा |
| जीनोमिक | 1 एनजी-1 μg |
| प्लाज्मिड या वायरल | 1 पीजी-1 एनजी |
2) बी.विशेष अनुप्रयोगों में टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की इष्टतम सांद्रता 5-50 यूनिट/एमएल (0.1-0.5 यूनिट/25 μL प्रतिक्रिया) तक हो सकती है।
थर्मल साइकलिंग प्रोटोकॉल
पीसीआर
| कदम | तापमान(डिग्री सेल्सियस) | समय | साइकिल |
| प्रारंभिक विकृतीकरणa | 95 ℃ | 1-3 मिनट | - |
| विकृतीकरण | 95 ℃ | 15-30 एस | 30-35 चक्र |
| एनीलिंगबी | 45-68 ℃ | 15-60 एस | |
| विस्तार | 68 ℃ | 1 केबी/मिनट | |
| अंतिम विस्तार | 68 ℃ | 5 मिनट | - |
टिप्पणियाँ:
1) 95°C पर 1 मिनट का प्रारंभिक विकृतीकरण अधिकांश प्रवर्धन के लिए पर्याप्त है।कठिन टेम्पलेट्स के लिए, 95°C पर 2-3 मिनट की लंबी विकृतीकरण की अनुशंसा की जाती है।कॉलोनी पीसीआर के साथ, 95°C पर प्रारंभिक 5 मिनट के विकृतीकरण की सिफारिश की जाती है।
2) एनीलिंग चरण आम तौर पर 15-60 सेकेंड का होता है।एनीलिंग तापमान प्राइमर जोड़ी के टीएम पर आधारित होता है और आमतौर पर 45-68℃ होता है।
