Rnase अवरोधक
म्यूरिन आरएनएज़ अवरोधक एक पुनः संयोजक म्यूरिन आरएनएज़ अवरोधक है जिसे ई.कोली से व्यक्त और शुद्ध किया जाता है।यह गैर-सहसंयोजक बंधन के माध्यम से 1:1 के अनुपात में RNase A, B या C से जुड़ता है, जिससे तीन एंजाइमों की गतिविधि बाधित होती है और RNA को क्षरण से बचाया जाता है।हालाँकि, यह एस्परगिलस के RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H या RNase के विरुद्ध प्रभावी नहीं है।म्यूरिन आरएनएएस अवरोधक का परीक्षण आरटी-पीसीआर, आरटी-क्यूपीसीआर और आईवीटी एमआरएनए द्वारा किया गया था, और यह विभिन्न वाणिज्यिक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, डीएनए पोलीमरेज़ और आरएनए पोलीमरेज़ के साथ संगत था।
मानव RNase अवरोधकों की तुलना में, म्यूरिन RNase अवरोधक में दो सिस्टीन नहीं होते हैं जो ऑक्सीकरण के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं जो अवरोधक को निष्क्रिय करने का कारण बनते हैं।यह इसे डीटीटी की कम सांद्रता (1 एमएम से कम) पर स्थिर बनाता है।यह सुविधा इसे उन प्रतिक्रियाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त बनाती है जहां डीटीटी की उच्च सांद्रता प्रतिक्रिया के प्रतिकूल होती है (जैसे वास्तविक समय आरटी-पीसीआर)।
Aआवेदन
इस उत्पाद का व्यापक रूप से किसी भी प्रयोग में उपयोग किया जा सकता है जहां आरएनए क्षरण से बचने के लिए आरएनएएस हस्तक्षेप संभव है, जैसे:
1.सीडीएनए, आरटी-पीसीआर, आरटी-क्यूपीसीआर, आदि के पहले स्ट्रैंड का संश्लेषण।
2.इन विट्रो प्रतिलेखन/अनुवाद (उदाहरण के लिए, इन विट्रो वायरल प्रतिकृति प्रणाली) के दौरान आरएनए को क्षरण से बचाता है।
3.आरएनए पृथक्करण और शुद्धिकरण के दौरान आरएनएएस गतिविधि का निषेध।
जमा करने की अवस्था
उत्पाद को -25～-15 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है, जो 2 वर्षों के लिए वैध है।
भंडारण बफ़र
50 एमएम केसीएल, 20 एमएम हेप्स-कोह (पीएच 7.6, 25 ℃), 8 एमएम डीटीटी और 50% ग्लिसरॉल।
इकाई परिभाषा
राइबोन्यूक्लिज़ ए के 5ng की गतिविधि को 50% तक बाधित करने के लिए आवश्यक म्यूरिन आरएनज़ अवरोधक की मात्रा को एक इकाई (यू) के रूप में परिभाषित किया गया था।
प्रोटीन का आणविक भार
म्यूरिन RNase अवरोधक का आणविक भार 50 kDa है।
गुणवत्ता नियंत्रण
एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि:
1 μg λ -Hind III डाइजेस्ट डीएनए के साथ 40 यू म्यूरिन आरएनज़ अवरोधक 16 घंटे के लिए 37℃ पर डीएनए को पचाता है, जिससे कोई गिरावट नहीं होती है, जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।
एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि:
16 घंटे के लिए 37℃ पर 1μg λ डीएनए के साथ म्यूरिन आरएनसे अवरोधक के 40 यू से कोई क्षरण नहीं होता है, जैसा कि एगरोज़ जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा निर्धारित किया गया है।
निकिंग गतिविधि:
16 घंटे के लिए 37℃ पर 1μg pBR322 के साथ 40U म्यूरीन RNase अवरोधक का कोई क्षरण नहीं होता है, जैसा कि agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा निर्धारित किया गया है।
RNase गतिविधि:
37℃ पर 4 घंटे के लिए 1.6μg MS2 RNA के साथ 40U म्यूरिन RNase अवरोधक कोई क्षरण नहीं देता है जैसा कि agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा निर्धारित किया गया है।
E.कोलाई डीएनए:
ई. कोलाई 16एस आरआरएनए लोकस के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ टाकमैन क्यूपीसीआर का उपयोग करके ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए की उपस्थिति के लिए म्यूरिन आरएनएस अवरोधक के 40 यू की जांच की जाती है।ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए संदूषण ≤ 0.1 पीजी/40 यू है।
Notes
1. हिंसक दोलन या सरगर्मी से एंजाइम निष्क्रिय हो जाएगा।
2. इस अवरोधक की इष्टतम तापमान सीमा 25-55 ℃ थी, और इसे 65 ℃ और उससे अधिक पर निष्क्रिय किया गया था।
3. RNase H, RNase 1 और RNase T1 की गतिविधियाँ म्यूरिन RNase अवरोधक द्वारा बाधित नहीं हुईं।
4. RNase गतिविधि का निषेध pH की एक विस्तृत श्रृंखला में पाया गया (pH 5-9 सभी सक्रिय थे), और उच्चतम गतिविधि pH 7-8 पर देखी गई।
5.चूंकि राइबोन्यूक्लिअस आमतौर पर विकृतीकरण स्थितियों के तहत गतिविधि बनाए रखता है, इसलिए आरएनएएस अवरोधक अणुओं को विकृत करने से बचने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए जो राइबोन्यूक्लिअस के साथ जटिल हो गए हैं।सक्रिय राइबोन्यूक्लिज़ की रिहाई को रोकने के लिए, 50 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान और यूरिया या अन्य विकृतीकरण एजेंटों की उच्च सांद्रता से बचा जाना चाहिए।
