वाइल्ड टाक डीएनए पोलीमरेज़
टाक डीएनए पोलीमरेज़ थर्मस एक्वाटिकस YT-1 से एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ है, जिसमें 5′→3′ पोलीमरेज़ गतिविधि और 5´ फ्लैप एंडोन्यूक्लिज़ गतिविधि होती है।
अवयव
| अवयव | HC1010ए-01 | HC1010ए-02 | HC1010ए-03 | HC1010ए-04 |
| 10× टैक बफर | 2×1 एमएल | 2×10 एमएल | 2×50 एमएल | 5×200 एमएल |
| टाक डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू/μL) | 0.1 एमएल | 1 एमएल | 5 एमएल | 5×10 एमएल |
गोदाम की स्थिति
0°C के तहत परिवहन और -25°C~-15°C पर भंडारण किया जाए।
इकाई परिभाषा
एक इकाई को एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है जो 75 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट में एसिड अघुलनशील सामग्री में 15 एनएमओएल डीएनटीपी को शामिल करता है।
गुणवत्ता नियंत्रण
1.प्रोटीन शुद्धता परख (एसडीएस-पेज):टाक डीएनए पोलीमरेज़ की शुद्धता एसडीएस-पेज विश्लेषण द्वारा ≥95% निर्धारित की गई थी।
2.Endओन्यूक्लिज़ गतिविधि:37 ℃ पर 16 घंटे के लिए 1 μg λDNA के साथ न्यूनतम 5 यू टैक डीएनए पोलीमरेज़ के परिणामस्वरूप कोई पता लगाने योग्य गिरावट नहीं होती है, जैसा कि निर्धारित किया गया है।
3.एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि:37 ℃ पर 16 घंटे तक 1 μg λ -Hind Ⅲ डाइजेस्ट डीएनए के साथ न्यूनतम 5 यू टाक डीएनए पोलीमरेज़ के परिणामस्वरूप कोई पता लगाने योग्य गिरावट नहीं होती है, जैसा कि निर्धारित किया गया है।
4.निकसे गतिविधि:37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 1 μg पीबीआर322 डीएनए के साथ न्यूनतम 5 यू टाक डीएनए पोलीमरेज़ के परिणामस्वरूप कोई पता लगाने योग्य गिरावट नहीं होती है, जैसा कि निर्धारित किया गया है।
5.RNase गतिविधि:37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 1.6 माइक्रोग्राम एमएस2 आरएनए के साथ न्यूनतम 5 यू टाक डीएनए पोलीमरेज़ के परिणामस्वरूप कोई पता लगाने योग्य गिरावट नहीं होती है, जैसा कि निर्धारित किया गया है।
6.ई कोलाईडीएनए:ई. कोलाई 16एस आरआरएनए लोकस के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ टैकमैन क्यूपीसीआर का उपयोग करके ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए की उपस्थिति के लिए टैक डीएनए पोलीमरेज़ के 5 यू की जांच की जाती है।ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए संदूषण ≤1 कॉपी है।
7.पीसीआर प्रवर्धन (5.0 केबी लैम्ब्डा डीएनए)- पीसीआर प्रवर्धन के 25 चक्रों के लिए टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की 5 इकाइयों के साथ 5 एनजी लैम्ब्डा डीएनए युक्त 50 μL प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप अपेक्षित 5.0 केबी उत्पाद प्राप्त होता है।
प्रतिक्रिया सेटअप
| अवयव | आयतन |
| टेम्पलेट डीएनएa | वैकल्पिक |
| 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर | 1 μL |
| 10 μM रिवर्स प्राइमर | 1 μL |
| dNTP मिक्स (प्रत्येक 10mM) | 1 μL |
| 10×टैक बफ़र | 5 μL |
| टाक डीएनए पोलीमरेज़बी | 0.25 μL |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | 50 μL तक |
टिप्पणियाँ:
1) विभिन्न टेम्पलेट्स की इष्टतम प्रतिक्रिया सांद्रता अलग-अलग होती है।निम्न तालिका 50 µL प्रतिक्रिया प्रणाली के अनुशंसित टेम्पलेट उपयोग को दर्शाती है।
| डीएनए | मात्रा |
| जीनोमिक | 1 एनजी-1 μg |
| प्लाज्मिड या वायरल | 1 पीजी-1 एनजी |
2) विशेष अनुप्रयोगों में टाक डीएनए पोलीमरेज़ की इष्टतम सांद्रता 0.25 μL~1 μL तक हो सकती है।
प्रतिक्रियाकार्यक्रम
| कदम | तापमान(डिग्री सेल्सियस) | समय | साइकिल |
| प्रारंभिक विकृतीकरणa | 95 ℃ | 5 मिनट | - |
| विकृतीकरण | 95 ℃ | 15-30 एस | 30-35 चक्र |
| एनीलिंगबी | 60 ℃ | 15 एस | |
| विस्तार | 72 ℃ | 1 केबी/मिनट | |
| अंतिम विस्तार | 72 ℃ | 5 मिनट | - |
टिप्पणियाँ:
1) प्रारंभिक विकृतीकरण स्थिति अधिकांश प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त है और इसे टेम्पलेट संरचना की जटिलता के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।यदि टेम्पलेट संरचना जटिल है, तो प्रारंभिक विकृतीकरण प्रभाव को बेहतर बनाने के लिए पूर्व-विकृतीकरण समय को 5-10 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है।
2) एनीलिंग तापमान को प्राइमर के टीएम मान के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होती है, जो आम तौर पर प्राइमर के टीएम मान से 3 ~ 5 ℃ कम पर सेट होता है;जटिल टेम्पलेट्स के लिए, कुशल प्रवर्धन प्राप्त करने के लिए एनीलिंग तापमान को समायोजित करना और विस्तार समय का विस्तार करना आवश्यक है।
