प्रोटीनेज के एमएनजीएस (तरल)
प्रोटीनेज़ K व्यापक सब्सट्रेट विशिष्टता वाला एक स्थिर सेरीन प्रोटीज़ है।यह डिटर्जेंट की उपस्थिति में भी कई प्रोटीनों को मूल अवस्था में ही नष्ट कर देता है।क्रिस्टल और आणविक संरचना अध्ययनों से प्राप्त साक्ष्य से संकेत मिलता है कि एंजाइम एक सक्रिय साइट उत्प्रेरक ट्रायड (एएसपी) के साथ सबटिलिसिन परिवार से संबंधित है।39-उसका69-सेर224).दरार का प्रमुख स्थान अवरुद्ध अल्फा अमीनो समूहों के साथ स्निग्ध और सुगंधित अमीनो एसिड के कार्बोक्सिल समूह से सटे पेप्टाइड बंधन है।इसका उपयोग आमतौर पर इसकी व्यापक विशिष्टता के लिए किया जाता है।यह प्रोटीनेज़ K विशेष रूप से mNGS के लिए डिज़ाइन किया गया है।अन्य प्रोटीनएज़ K की तुलना में, इसमें समान एंजाइमेटिक प्रदर्शन के साथ कम न्यूक्लिक एसिड संदूषण होता है, जो डाउनस्ट्रीम mNGS अनुप्रयोग को बेहतर ढंग से सुनिश्चित कर सकता है।
जमा करने की अवस्था
2 साल के लिए 2-8℃
विनिर्देश
| उपस्थिति | रंगहीन से हल्का भूरा तरल |
| गतिविधि | ≥800 यू/एमएल |
| प्रोटीन सांद्रण | ≥20 मिलीग्राम/एमएल |
| Nickase | किसी का पता नहीं चला |
| DNase | किसी का पता नहीं चला |
| RNase | किसी का पता नहीं चला |
गुण
| ईसी नंबर | 3.4.21.64(ट्रिटिराचियम एल्बम से पुनः संयोजक) |
| समविभव बिंदु | 7.81 |
| इष्टतम पीएच | 7.0-12.0 चित्र 1 |
| इष्टतम तापमान | 65 ℃ चित्र 2 |
| पीएच स्थिरता | पीएच 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 घंटे) चित्र 3 |
| तापीय स्थिरता | 50 ℃ से नीचे (पीएच 8.0, 30 मिनट) चित्र 4 |
| संग्रहण का स्थायित्व | 25 ℃ पर 12 महीने के लिए 90% से अधिक गतिविधि |
| सक्रियकर्ता | एसडीएस, यूरिया |
| इनहिबिटर्स | डायसोप्रोपाइल फ्लोरोफॉस्फेट;फेनिलमेथिलसल्फोनील फ्लोराइड |
अनुप्रयोग
1. जेनेटिक डायग्नोस्टिक किट
2. आरएनए और डीएनए निष्कर्षण किट
3. ऊतकों से गैर-प्रोटीन घटकों का निष्कर्षण, डीएनए जैसी प्रोटीन अशुद्धियों का क्षरणटीके और हेपरिन की तैयारी
4. स्पंदित वैद्युतकणसंचलन द्वारा गुणसूत्र डीएनए की तैयारी
5. पश्चिमी धब्बा
6. इन विट्रो डायग्नोसिस में एंजाइमेटिक ग्लाइकोसिलेटेड एल्ब्यूमिन अभिकर्मक
सावधानियां
उपयोग या वजन करते समय सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पहनें, और उपयोग के बाद अच्छी तरह हवादार रखें।इस उत्पाद से त्वचा में एलर्जी और आंखों में गंभीर जलन हो सकती है।यदि यह साँस के साथ अंदर चला जाता है, तो इससे एलर्जी या अस्थमा के लक्षण या सांस की तकलीफ हो सकती है।श्वसन संबंधी जलन हो सकती है.
इकाई परिभाषा
एक इकाई (यू) को 1 μmol का उत्पादन करने के लिए कैसिइन को हाइड्रोलाइज करने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया हैनिम्नलिखित परिस्थितियों में प्रति मिनट टायरोसिन।
अभिकर्मकों की तैयारी
अभिकर्मक I: 1 ग्राम दूध कैसिइन को 50 मिलीलीटर 0.1M सोडियम फॉस्फेट घोल (पीएच 8.0) में घोला गया, 15 मिनट के लिए 65-70 ℃ पानी में डाला गया, हिलाया और घोला गया, पानी से ठंडा किया गया, सोडियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा पीएच 8.0 पर समायोजित किया गया, और निश्चित मात्रा 100 मि.ली.
अभिकर्मक II: 0.1M ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड, 0.2M सोडियम एसीटेट, 0.3M एसिटिक एसिड।
अभिकर्मक III: 0.4M Na2CO3समाधान।
अभिकर्मक IV: फ़ोरिंट अभिकर्मक को 5 बार शुद्ध पानी से पतला किया गया।
अभिकर्मक V: एंजाइम मंदक: 0.1M सोडियम फॉस्फेट समाधान (पीएच 8.0)।
अभिकर्मक VI: टायरोसिन घोल: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 यूमोल/एमएल टायरोसिन 0.2 के साथ घुल गयाएम एचसीएल.
प्रक्रिया
1. 0.5 मिली अभिकर्मक I को 37℃ पर पहले से गरम करें, 0.5 मिली एंजाइम घोल डालें, अच्छी तरह मिलाएं, और इनक्यूबेट करें10 मिनट के लिए 37℃।
2. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1 मिलीलीटर अभिकर्मक II जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और 30 मिनट तक ऊष्मायन जारी रखें।
3. अपकेंद्रित्र प्रतिक्रिया समाधान।
4. 0.5 मिली सुपरनेटेंट लें, 2.5 मिली अभिकर्मक III, 0.5 मिली अभिकर्मक IV डालें, अच्छी तरह मिलाएं और 37℃ पर इनक्यूबेट करें30 मिनट के लिए.
5. आयुध डिपो660OD के रूप में निर्धारित किया गया था1;रिक्त नियंत्रण समूह: एंजाइम को बदलने के लिए 0.5 मिलीलीटर अभिकर्मक वी का उपयोग किया जाता हैOD निर्धारित करने का समाधान660ओडी के रूप में2, ΔOD=OD1-ओडी2.
6. एल-टायरोसिन मानक वक्र: 0.5 एमएल विभिन्न सांद्रता एल-टायरोसिन समाधान, 2.5 एमएल अभिकर्मक III, 5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.5 एमएल अभिकर्मक IV, 30 मिनट के लिए 37 ℃ में सेते हैं, ओडी का पता लगाते हैं660एल-टायरोसिन की विभिन्न सांद्रता के लिए, फिर मानक वक्र Y=kX+b प्राप्त किया, जहां Y एल-टायरोसिन एकाग्रता है, X OD है600.
गणना
2: प्रतिक्रिया समाधान की कुल मात्रा (एमएल)
0.5: एंजाइम समाधान की मात्रा (एमएल)
0.5: क्रोमोजेनिक निर्धारण (एमएल) में प्रयुक्त प्रतिक्रिया तरल मात्रा
10: प्रतिक्रिया समय (न्यूनतम)
Df: तनुकरण एकाधिक
C: एंजाइम सांद्रता (मिलीग्राम/एमएल)
संदर्भ
1. विएगर यू और हिल्ज़ एच. एफईबीएस लेट।(1972);23:77.
2. विएगर यू और हिल्ज़ एच. बायोकेम।बायोफिज़।रेस.कम्यून.(1971);44:513.
3. हिल्ज़, एच.और अन्य।,ईयूआर।जे. बायोकेम.(1975);56:103-108.
4. सैम्ब्रूक जेet अल., आणविक क्लोनिंग: एक प्रयोगशाला मैनुअल, दूसरा संस्करण, कोल्ड स्प्रिंग हार्बरप्रयोगशाला प्रेस, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर (1989)।
आंकड़ों
अंजीर.1 अनुकूलतम pH
100mM बफर समाधान:pH6.0-8.0, Na-फॉस्फेट;पीएच8.0-9.0, ट्रिस-एचसीएल;pH9.0-12.5, ग्लाइसिन-NaOH.एंजाइम सांद्रता: 1mg/mL
चित्र.2 इष्टतम तापमान
20 एमएम के-फॉस्फेट बफर पीएच 8.0 में प्रतिक्रिया।एंजाइम सांद्रता: 1 मिलीग्राम/एमएल
चित्र 3 पीएच स्थिरता
25 ℃, 50 एमएम बफर समाधान के साथ 16 एच-उपचार: पीएच 4.5-5.5, एसीटेट;पीएच 6.0-8.0, ना-फॉस्फेट;पीएच 8.0-9.0, ट्रिस-एचसीएल.pH 9.0- 12.5, ग्लाइसीन-NaOH.एंजाइम सांद्रता: 1 मिलीग्राम/एमएल
चित्र.4 थर्मल स्थिरता
50 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर, पीएच 8.0 के साथ 30 मिनट का उपचार।एंजाइम सांद्रता: 1 मिलीग्राम/एमएल
चित्र.5 भंडारण स्थिरताty at 25℃
