आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस
आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक आरएनए टेम्पलेट-निर्भर डीएनए पोलीमरेज़ है जिसमें 3'→5' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि का अभाव है और इसमें आरएनएएस एच गतिविधि है।यह एंजाइम डीएनए के पूरक स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में आरएनए का उपयोग कर सकता है, जिसे पहले-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण पर लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से आरटी-एलएएमपी (लूप-मध्यस्थ इज़ोटेर्मल एम्प्लीफिकेशन) के लिए।आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 1.0 की तुलना में, संवेदनशीलता में काफी सुधार हुआ है, थर्मल स्थिरता मजबूत है, और 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया अधिक स्थिर है।आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (ग्लिसरॉल मुक्त) का उपयोग लियोफिलाइज्ड तैयारी, लियोफिलाइज्ड आरटी-एलएएमपी अभिकर्मकों आदि को तैयार करने के लिए किया जा सकता है।
इकाई परिभाषा
एक इकाई टेम्पलेट-प्राइमर के रूप में पॉली (ए) ऑलिगो (डीटी) 25 का उपयोग करके 50 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट में एसिड-अवक्षेपणीय सामग्री में 1 एनएमओएल डीटीटीपी शामिल करती है।
अवयव
| अवयव | एचसी5008A-01 | एचसी5008A-02 | एचसी5008A-03 |
| आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (ग्लिसरॉल-मुक्त) (15यू/μL) | 0.1 एमएल | 1 एमएल | 10 एमएल |
| 10×एचसी आरटीएल बफर | 1.5 एमएल | 4×1.5 एमएल | 5×10 एमएल |
| एमजीएसओ4 (100एमएम) | 1.5 एमएल | 2×1.5 एमएल | 3×10 एमएल |
गोदाम की स्थिति
0°C के तहत परिवहन और -25°C~-15°C पर भंडारण किया जाए।
गुणवत्ता नियंत्रण
- की अवशिष्ट गतिविधिEएनडोन्यूक्लिज़:एक 50 μL प्रतिक्रिया जिसमें 1 μg λDNA और 15 इकाइयाँ RTL2.0 शामिल हैं, 37 ℃ पर 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट की गई, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के समान पैटर्न दिखाती है।
- की अवशिष्ट गतिविधिएक्सोन्यूक्लिज़:एक 50 μL प्रतिक्रिया जिसमें 1 μg हिंद Ⅲ पचा हुआ λDNA और आरटीएल 2.0 की 15 इकाइयाँ शामिल हैं, जो 37 ℃ पर 16 घंटे के लिए इनक्यूबेट की गई हैं, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के समान पैटर्न दिखाती हैं।
- की अवशिष्ट गतिविधिNickase:एक 50 μL प्रतिक्रिया जिसमें 1 μg सुपरकोइल्ड pBR322 और 15 यूनिट RTL2.0 शामिल हैं, 37°C पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के समान पैटर्न दिखाता है।
- की अवशिष्ट गतिविधिRNase:एक 10 μL प्रतिक्रिया जिसमें 0.48 μg MS2 RNA और 15 इकाइयाँ RTL2.0 शामिल हैं, को 37°C पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के समान पैटर्न दिखाता है।
- ई कोलाई gडीएनए:से नापा गयाई कोलाईविशिष्ट HCD डिटेक्शन किट, RTL2.0 की 15 इकाइयों में 1 से कम होता हैई कोलाईजीनोम.
प्रतिक्रिया सेटअप
सीडीएनए संश्लेषण प्रोटोकॉल
| अवयव | आयतन |
| टेम्पलेट आरएनए ए | वैकल्पिक |
| ओलिगो(डीटी) 18~25(50यूएम) या रैंडम प्राइमर मिक्स(60यूएम) | 2 μL |
| dNTP मिक्स (प्रत्येक 10mM) | 1 μL |
| RNase अवरोधक (40U/uL) | 0.5 μL |
| आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 2.0 (15यू/यूएल) | 0.5 μL |
| 10×एचसी आरटीएल बफर | 2 μL |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | 20 μL तक |
टिप्पणियाँ:
1) कुल आरएनए की अनुशंसित खुराक 1ng~1μg है
2) एमआरएनए की अनुशंसित खुराक 50ng~100ng थी
थर्मामीटरों-दिनचर्या के लिए साइकिल चलाने की शर्तें प्रतिक्रिया:
| तापमान (डिग्री सेल्सियस) | समय |
| 25 डिग्री सेल्सियसa | 5 मिनट |
| 55 डिग्री सेल्सियस | 10 मिनिटb |
| 80 डिग्री सेल्सियस | 10 मिनिट |
टिप्पणियाँ:
1) यदि रैंडम प्राइमर मिक्स का उपयोग किया जाता है, तो 25 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊष्मायन चरण।
2) यदि लक्ष्य प्राइमर मिश्रण का उपयोग किया जाता है, तो 10 ~ 30 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊष्मायन चरण।
आरटी-लैंप प्रोटोकॉल
| अवयव | आयतन | अंतिम एकाग्रता |
| टेम्पलेट आरएनए | वैकल्पिक | ≥10 प्रतियां |
| डीएनटीपी मिक्स (10एमएम) | 3.5 μL | 1.4 मिमी |
| एफआईपी/बीआईपी प्राइमर (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 प्राइमर (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| लूपएफ/लूपबी प्राइमर (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase अवरोधक (40U/μL) | 0.5 μL | 20 यू/प्रतिक्रिया |
| आरटीएल रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस 2.0 (15यू/μL) | 0.5 μL | 7.5 यू/प्रतिक्रिया |
| बीएसटी वी2 डीएनए पोलीमरेज़ (8यू/μL) | 1 μL | 8 यू/प्रतिक्रिया |
| एमजीएसओ4 (100एमएम) | 1.5 μL | 6 एमएम (कुल 8 एमएम) |
| 10×एचसी आरटीएल बफर (या 10×एचसी बीएसटी वी2 बफर) | 2.5 μL | 1 × (2एमएम एमजी2+) |
| न्यूक्लियस मुक्त पानी | 25 μL तक | - |
टिप्पणियाँ:
1) इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में भंवर और अपकेंद्रित्र द्वारा मिश्रण करें।1 घंटे के लिए 65°C पर लगातार तापमान ऊष्मायन।
2) दो बफ़र्स इंटरऑपरेबल हैं और उनकी संरचना समान है।
टिप्पणियाँ
1. -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर यह उत्पाद एक सफेद ठोस बन जाएगा।इसे -20°C से बाहर निकालें और लगभग 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।पिघलने के बाद इसे हिलाकर और मिलाकर इस्तेमाल किया जा सकता है।
2. सीडीएनए उत्पाद को -20°C या -80°C पर संग्रहीत किया जा सकता है या पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है।
3.RNase संदूषण को रोकने के लिए, कृपया प्रायोगिक क्षेत्र को साफ रखें, और ऑपरेशन के दौरान साफ दस्ताने और मास्क पहनें।
