एम-एमएलवी नियोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस
नियोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस है जो ई.कोली में मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस की उत्पत्ति और अभिव्यक्ति के एम-एमएलवी जीन की उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है।एंजाइम RNase H गतिविधि को हटा देता है, इसमें उच्च तापमान सहनशीलता होती है, और उच्च तापमान रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयुक्त है।इसलिए, यह सीडीएनए संश्लेषण पर आरएनए उच्च-स्तरीय संरचना और गैर-विशिष्ट कारकों के प्रतिकूल प्रभावों को खत्म करने में सहायक है, और इसमें उच्च स्थिरता और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन संश्लेषण क्षमता है।एंजाइम में उच्च स्थिरता और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन संश्लेषण क्षमता होती है।
अवयव
1.200 यू/μL नियोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस
2.5 × प्रथम-स्ट्रैंड बफर (वैकल्पिक)
* 5 × फर्स्ट-स्ट्रैंड बफ़र में dNTP शामिल नहीं है, कृपया प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करते समय dNTP जोड़ें
अनुशंसित आवेदन
1.एक-चरणीय क्यूआरटी-पीसीआर।
2.आरएनए वायरस का पता लगाना
गोदाम की स्थिति
दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20°C, उपयोग से पहले अच्छी तरह मिलाया जाना चाहिए, बार-बार जमने-पिघलने से बचें।
इकाई परिभाषा
एक इकाई पॉली (ए) ऑलिगो (डीटी) का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट में 1 एनएमओएल डीटीटीपी शामिल करती है।25टेम्पलेट/प्राइमर के रूप में।
गुणवत्ता नियंत्रण
1.एसडीएस-पेज इलेक्ट्रोफोरेटिक शुद्धता 98% से अधिक।
2.प्रवर्धन संवेदनशीलता, बैच-टू-बैच नियंत्रण, स्थिरता।
3.कोई बहिर्जात न्यूक्लिअस गतिविधि नहीं, कोई बहिर्जात एंडोन्यूक्लिज़ या एक्सोन्यूक्लिज़ संदूषण नहीं
प्रथम श्रृंखला प्रतिक्रिया समाधान के लिए प्रतिक्रिया सेटअप
1.प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी
| अवयव | आयतन |
| ओलिगो(डीटी)12-18 भजन की पुस्तक या रैंडम प्राइमरए या जीन विशिष्ट प्राइमरb | 50 pmol |
| 50 पीएमओएल (20-100 पीएमओएल) | |
| 2 pmol | |
| 10 एमएम डीएनटीपी | 1 μL |
| टेम्पलेट आरएनए | कुल आरएनए≤ 5μg;एमआरएनए≤ 1 μg |
| RNase मुक्त dH2O | 10 μL तक |
टिप्पणियाँ:ए/बी: कृपया अपनी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार विभिन्न प्रकार के प्राइमर चुनें।
2.5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और 2 मिनट के लिए बर्फ पर तेजी से ठंडा करें।
3.निम्नलिखित घटकों को उपरोक्त सिस्टम में 20μL की कुल मात्रा में जोड़ें और धीरे से मिलाएं:
| अवयव | आयतन (μL) |
| 5 × प्रथम-स्ट्रैंड बफर | 4 |
| नियोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (200 यू/μL) | 1 |
| RNase अवरोधक (40 यू/μL) | 1 |
| RNase मुक्त dH2O | 20 μL तक |
4.कृपया निम्नलिखित शर्तों के अनुसार प्रतिक्रिया करें:
(1) यदि रैंडम प्राइमर का उपयोग किया जाता है, तो प्रतिक्रिया 10 मिनट के लिए 25 ℃ पर और फिर 30 ~ 60 मिनट के लिए 50 ℃ पर की जानी चाहिए;
(2) यदि ओलिगो डीटी या विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग किया जाता है, तो प्रतिक्रिया 30 ~ 60 मिनट के लिए 50 ℃ पर की जानी चाहिए।
5.नियोस्क्रिप्ट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को निष्क्रिय करने और प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 95℃ पर गर्म करें।
6.रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पादों का उपयोग सीधे पीसीआर प्रतिक्रिया और प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रतिक्रिया में किया जा सकता है, या लंबे समय तक -20 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है।
पीसीआर आरप्रतिक्रिया：
1.प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी
| अवयव | एकाग्रता |
| 10 × पीसीआर बफर (डीएनटीपी मुक्त, एमजी²+ मुक्त) | 1× |
| dNTPs (10mM प्रत्येक dNTP) | 200 μM |
| 25 एमएम एमजीसीएल2 | 1-4 मिमी |
| टाक डीएनए पोलीमरेज़ (5U/μL) | 2-2.5 यू |
| प्राइमर 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| प्राइमर 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| खाकाए | ≤10% प्रथम श्रृंखला प्रतिक्रिया समाधान (2 μL) |
| डीडीएच2O | 50 μL तक |
टिप्पणियाँ:ए: यदि बहुत अधिक प्रथम श्रृंखला प्रतिक्रिया समाधान जोड़ा जाता है, तो पीसीआर प्रतिक्रिया बाधित हो सकती है।
2.पीसीआर प्रतिक्रिया प्रक्रिया
| कदम | तापमान | समय | साइकिल |
| पूर्व विकृतीकरण | 95℃ | 2-5 मिनट | 1 |
| विकृतीकरण | 95℃ | 10-20 सेकंड | 30-40 |
| एनीलिंग | 50-60℃ | 10-30 सेकंड | |
| विस्तार | 72℃ | 10-60 सेकंड |
टिप्पणियाँ
1.42℃~55℃ की सीमा में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन तापमान अनुकूलन के लिए उपयुक्त।
2.इसमें बेहतर स्थिरता है, यह उच्च तापमान रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रवर्धन के लिए उपयुक्त है।इसके अलावा, यह आरएनए के जटिल संरचनात्मक क्षेत्रों से कुशलतापूर्वक गुजरने के लिए अनुकूल है।इसके अलावा, यहएक-चरणीय मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति मात्रात्मक आरटी-पीसीआर पहचान के लिए उपयुक्त है।
3.विभिन्न पीसीआर प्रवर्धन एंजाइमों के साथ अच्छी संगतता और उच्च संवेदनशीलता आरटी-पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए उपयुक्त है।
4.उच्च संवेदनशीलता एक-चरण प्रतिदीप्ति मात्रात्मक आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए उपयुक्त, टेम्पलेट्स की कम सांद्रता की पहचान दर में प्रभावी ढंग से सुधार करता है।
5.सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण के लिए उपयुक्त।
