एंडोफ्री प्लास्मिड मैक्सी किट
यह किट बैक्टीरिया को नष्ट करने के लिए एक बेहतर एसडीएस-क्षारीय लसीका विधि का उपयोग करके, रात भर संवर्धित 150 - 300 मिलीलीटर जीवाणु समाधान से निष्कर्षण के लिए उपयुक्त है।कच्चे अर्क को चुनिंदा रूप से एक अद्वितीय एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर के साथ जोड़ा जाता है और एंडोटॉक्सिन को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है।फिर, सिलिका जेल झिल्ली उच्च-नमक और निम्न-पीएच की स्थितियों के तहत समाधान में प्लास्मिड डीएनए को चुनिंदा रूप से बांधती है।इसके बाद अशुद्धियों और अन्य जीवाणु घटकों को हटाने के लिए वॉश बफर को जोड़ा जाता है।अंत में, सिलिकॉन मैट्रिक्स झिल्ली से शुद्ध प्लास्मिड डीएनए को निकालने के लिए कम नमक, उच्च पीएच रेफरेंस बफर का उपयोग किया जाता है।सिलिका जेल झिल्ली विशेष सोखने वाली झिल्ली का उपयोग करती है, और स्तंभ और स्तंभ के बीच सोखने की मात्रा का अंतर बहुत छोटा होता है और पुनरावृत्ति अच्छी होती है।फिनोल, क्लोरोफॉर्म और अन्य जहरीले अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है, और न ही इथेनॉल अवक्षेपण चरणों की आवश्यकता है।इस किट का उपयोग 80% -90% की निष्कर्षण दर के साथ 0.2 -1.5 मिलीग्राम शुद्ध उच्च-कॉपी प्लास्मिड डीएनए को तेजी से निकालने के लिए किया जा सकता है।किट एक अद्वितीय प्रक्रिया सूत्र का उपयोग करती है जो एंडोटॉक्सिन को हटाती है, एंडोटॉक्सिन की सामग्री बेहद कम है और सेल ट्रांसफ़ेक्शन प्रभाव उत्कृष्ट है।निकाले गए प्लास्मिड का उपयोग सीधे एंजाइम पाचन, पीसीआर, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, परिवर्तन, अनुक्रमण और अन्य आणविक जीवविज्ञान प्रयोगों में किया जा सकता है।
जमा करने की अवस्था
RNaseA को -30 ~ -15℃ पर संग्रहित किया जाना चाहिए और ≤0℃ पर परिवहन किया जाना चाहिए।
एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर को एक महीने के लिए 2 ~ 8 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है, दीर्घकालिक भंडारण के लिए -30 ~ -15 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता हैऔर ≤0℃ पर परिवहन किया गया।
अन्य घटकों को कमरे के तापमान (15 ~ 25℃) पर संग्रहित किया जाना चाहिए और कमरे के तापमान पर परिवहन किया जाना चाहिए।
अवयव
| अवयव | 10RXNS |
| आरएनएसई ए | 750 μL |
| बफ़र P1 | 75 मि.ली |
| बफर पी2 | 75 मि.ली |
| बफ़र P4 | 75 मि.ली |
| एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर | 25 मि.ली |
| बफर पीडब्लू | 2×22 मि.ली |
| बफर टीबी | 20 मि.ली |
| फास्टप्योर डीएनए मैक्सी कॉलम (प्रत्येक 50 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में) | 10 |
| एंडोटॉक्सिन मुक्त संग्रह ट्यूब | 2×5 |
RNaseA:10 मिलीग्राम/एमएल, आरएनए को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है।
बफ़र P1:बैक्टीरियल सस्पेंशन बफ़र, पहले उपयोग से पहले बफ़र P1 में RNaseA जोड़ें।
बफ़र P2:बैक्टीरियल लाइसिस बफर (SDS/NaOH युक्त)।
बफ़र P4:बफर को निष्क्रिय करना।
एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर:क्रूड प्लास्मिड अर्क से एंडोटॉक्सिन को प्रभावी ढंग से हटा दें।
बफर पीडब्लू:बफर धोएं, पहले उपयोग से पहले इथेनॉल की निर्धारित मात्रा जोड़ें।
बफर टीबी:निक्षालन बफर.
फास्टप्योर डीएनए मैक्सी कॉलम:प्लास्मिड डीएनए सोखना कॉलम।
संग्रह ट्यूब 50 मिली:छानने संग्रह ट्यूब.
एंडोटॉक्सिन मुक्त संग्रह ट्यूब:प्लास्मिड डीएनए संग्रह ट्यूब।
तैयार सामग्री
पूर्ण इथेनॉल, आइसोप्रोपेनॉल, 50 मिली राउंड-बॉटम सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और 50 मिली एंडोटॉक्सिन-मुक्तअपकेंद्रित्र ट्यूब.
अनुप्रयोग
यह उत्पाद 150 - 300 मिलीलीटर जीवाणु समाधान से प्लास्मिड के बड़े पैमाने पर निष्कर्षण के लिए उपयुक्त हैरातों-रात सुसंस्कृत किया।
प्रयोग प्रक्रिया
1. रात भर संवर्धित जीवाणु घोल का 150 - 200 मिलीलीटर (300 मिलीलीटर से अधिक नहीं) लें और इसे सेंट्रीफ्यूज करें।1-2 मिनट के लिए लगभग 11,000 आरपीएम (12,000 × ग्राम)।सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बैक्टीरिया इकट्ठा करें।
Δ 50 मिलीलीटर से अधिक जीवाणु समाधान एकत्र करते समय, बैक्टीरिया को उसी 50 मिलीलीटर ट्यूब में जीवाणु समाधान, सेंट्रीफ्यूजेशन, सतह पर तैरनेवाला को त्यागने और अन्य चरणों को जोड़कर एकत्र किया जा सकता है।
कई बार।
2. सेंट्रीफ्यूज में 7.5 मिली बफर पी1 मिलाएं (कृपया जांचें कि क्या आरएनएएसईए को बफर पी1 में जोड़ा गया है)बैक्टीरिया युक्त ट्यूब और भँवर या पिपेटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
Δ इस चरण में बैक्टीरिया का पूर्ण पुनर्निलंबन उपज के लिए महत्वपूर्ण है, और पुनर्निलंबन के बाद कोई जीवाणु गुच्छे नहीं होने चाहिए।यदि बैक्टीरिया के गुच्छे हैं जिन्हें पूरी तरह से मिश्रित नहीं किया गया है, तो यह लसीका को प्रभावित करेगा, जिसके परिणामस्वरूप कम उपज और शुद्धता होगी।यदि जीवाणु समाधान का OD600 0.65 है, तो यह अनुशंसा की जाती है कि 150 मिलीलीटर जीवाणु समाधान से निकालते समय 7.5 मिलीलीटर बफर पी1 का उपयोग किया जाए;जब OD600 0.75 है, तो बफर P1 के 8 मिलीलीटर का उपयोग किया जाना चाहिए और बफर P2 और P4 की मात्रा तदनुसार बदलनी चाहिए।यदि जीवाणु समाधान की मात्रा 200 मिलीलीटर तक बढ़ा दी जाती है, तो यह अनुशंसा की जाती है किबफ़र्स P1, P2 और P4 की मात्रा आनुपातिक रूप से बढ़ाई जाएगी।
3. चरण 2 से बैक्टीरियल सस्पेंशन में 7.5 मिली बफर पी2 मिलाएं और 6 - 8 तक धीरे-धीरे ऊपर-नीचे मिलाएं।कई बार और 4-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
Δ अच्छी तरह मिलाने के लिए धीरे से पलटें।भंवर से जीनोमिक डीएनए विखंडन हो जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप निकाले गए प्लास्मिड में जीनोमिक डीएनए टुकड़े हो जाएंगे।इस समय, घोल चिपचिपा और पारभासी हो जाता है, जिससे पता चलता है कि बैक्टीरिया पूरी तरह से नष्ट हो गया है।प्लास्मिड के विनाश से बचने के लिए अवधि 5 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए।यदि समाधान स्पष्ट नहीं है, तो इसके परिणामस्वरूप बहुत अधिक बैक्टीरिया हो सकते हैंअपूर्ण लसीका, इसलिए बैक्टीरिया की मात्रा उचित रूप से कम की जानी चाहिए।
4. चरण 3 से बैक्टीरियल सस्पेंशन में 7.5 मिली बफर पी4 मिलाएं और तुरंत धीरे से 6 - 8 बार पलटें ताकि घोल बफर पी2 को पूरी तरह से बेअसर कर दे।इस समय, सफेद फ़्लोकुलेंट अवक्षेप दिखाई देना चाहिए।10-15 मिनट के लिए लगभग 11,000 आरपीएम (12,000 × ग्राम) से अधिक पर सेंट्रीफ्यूज करें, सावधानीपूर्वक सतह पर तैरनेवाला को एक नई 50 मिलीलीटर गोल-तल वाली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (स्वयं तैयार) में पिपेट करें, और बचेंतैरते हुए सफेद अवक्षेप को महाप्राण करें।
Δ बफर पी4 डालें और अच्छी तरह मिलाने के लिए तुरंत पलटें।ट्यूब को तब तक खड़े रहने दें जब तक कि सफेद अवक्षेप पूरे घोल में समान रूप से वितरित न हो जाए ताकि स्थानीय वर्षा के उत्पादन को रोका जा सके जो तटस्थता को प्रभावित कर सकता है।यदि सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले कोई समान सफेद फ्लोकुलेंट अवक्षेप नहीं है और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट नहीं है, तो ट्यूब कोअगले 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया।
5. चरण 4 से सतह पर तैरनेवाला में 0.1 गुना मात्रा (सतह पर तैरनेवाला की मात्रा का 10%, लगभग 2.2 मिलीलीटर) एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए उल्टा करें।घोल को बर्फ के स्नान में रखें या कुचली हुई बर्फ (या रेफ्रिजरेटर फ्रीजर) में 5 मिनट के लिए डालें जब तक कि घोल बादल से साफ और पारदर्शी (या स्थिर) न हो जाएथोड़ा गंदला), और कभी-कभी कई बार मिश्रित होता है।
Δ एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर को सतह पर तैरनेवाला में जोड़ने के बाद, सतह पर तैरनेवाला गंदा हो जाएगा लेकिनबर्फ के स्नान में ठंडा होने के बाद सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट (या थोड़ा गंदला) हो जाना चाहिए।
6. सतह पर तैरनेवाला को 10 - 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (>25℃) पर रखने के बाद, यह गंदला हो जाएगाइसका तापमान कमरे के तापमान तक बढ़ जाता है।फिर मिश्रण करने के लिए सतह को उल्टा कर देना चाहिए।
Δ यदि कमरे का तापमान कम है या आप निष्कर्षण समय को कम करना चाहते हैं, तो सतह पर तैरनेवाला को 5 - 10 मिनट के लिए 37 ~ 42 ℃ पानी के स्नान में डाला जा सकता है और सतह पर तैरनेवाला के बाद अगला कदम उठाया जा सकता हैगंदला हो जाता है.
7. चरण को अलग करने के लिए सतह पर तैरनेवाला को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए लगभग 11,000 आरपीएम (12,000 × ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूज करें (तापमान> 25 ℃ होना चाहिए)।ऊपरी जलीय चरण में डीएनए होता है जबकि निचली नीली तैलीय चरण परत में एंडोटॉक्सिन और अन्य अशुद्धियाँ होती हैं।स्थानांतरित करेंएक नई ट्यूब के लिए डीएनए युक्त जलीय चरण औरतैलीय परत को हटा दें.
Δ सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान तापमान 25℃ से अधिक होना चाहिए क्योंकि प्रभावी चरण पृथक्करण नहीं होता हैयदि तापमान बहुत कम हो तो घटित होता है।
Δ यदि चरण पृथक्करण प्रभावी नहीं है, तो सेंट्रीफ्यूजेशन तापमान को 30℃ तक समायोजित किया जा सकता है औरसेंट्रीफ्यूजेशन का समय 15 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है।
Δ नीली तैलीय परत को न चूसें क्योंकि इसमें एंडोटॉक्सिन और अन्य अशुद्धियाँ होती हैं।
तंत्र
पुनर्निलंबन लसीका निष्प्रभावीकरण
◇ 7.5 मिलीलीटर बफर पी1 जोड़ें
◇ 7.5 मिली बफर पी2 डालें
◇ 7.5 मिली बफर पी4 डालें
एंडोटॉक्सिन हटाना
◇एंडोटॉक्सिन स्केवेंजर की सतह पर तैरनेवाला मात्रा का 0.1 गुना जोड़ें
बाँधना और धोना
◇ आइसोप्रोपेनॉल की मात्रा का 0.5 गुना जोड़ें
◇ 10 मिलीलीटर बफर पीडब्लू जोड़ें
◇ 10 मिलीलीटर बफर पीडब्लू जोड़ें
क्षालन
◇ 1 - 2 मिली बफर टीबी या एंडोटॉक्सिन-मुक्त ddH2O मिलाएं
