सीधे पीसीआर किट लगाएं
कैट नं: HCR2020A
प्लांट डायरेक्ट पीसीआर किट पौधों की पत्तियों, बीजों आदि के प्रत्यक्ष प्रवर्धन के लिए उपयुक्त है, और इसका उपयोग पौधों के नमूनों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है जिनमें पॉलीसेकेराइड और पॉलीफेनोल्स नहीं होते हैं।निर्देशित विकास पर आधारित प्रत्यक्ष प्रवर्धन डीएनए पोलीमरेज़ में पौधों में पीसीआर अवरोधकों के प्रति बेहतर सहनशीलता है।इस बीच, यह उच्च प्रवर्धन प्रदर्शन को बनाए रखता है, जो 5 केबी के भीतर डीएनए टुकड़ों के प्रवर्धन के लिए उपयुक्त है।किट में अद्वितीय लाइसिस बफर ए का उपयोग ताजा या जमे हुए पौधों के ऊतकों को लीज करने के लिए किया जा सकता है।इसे संचालित करना आसान है और लाइसेट को शुद्धिकरण के बिना प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है।सिस्टम में सुरक्षात्मक एजेंट होते हैं जो कच्चे नमूनों को बार-बार जमने और पिघलने के बाद प्रभावी ढंग से बढ़ाने में सक्षम बनाते हैं।2 × प्लांट डायरेक्ट मास्टर मिक्स को प्रवर्धन प्रतिक्रिया करने के लिए केवल प्राइमर और टेम्प्लेट जोड़ने की आवश्यकता होती है, जिससे पिपेटिंग संचालन कम हो जाता है और डिटेक्शन थ्रूपुट और परिणामों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता में सुधार होता है।
अवयव
| अवयव | 50 आरएक्सएनएस | 200 आरएक्सएनएस |
| 2 × प्लांट डायरेक्ट मास्टर मिक्स | 1.25 मि.ली | 4×1.25 मि.ली |
| प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर ए | 5 मिली | 20 मि.ली |
| प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर बी* | 5 मिली | 20 मि.ली |
*प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर बी एक वैकल्पिक अभिकर्मक है, जिसका उपयोग नमूनों के भंडारण समय को बढ़ाने के लिए प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर ए को बेअसर करने के लिए किया जाता है।इसका उपयोग वास्तविक स्थिति के अनुसार किया जा सकता है।
जमा करने की अवस्था
2 × प्लांट डायरेक्ट मास्टर मिक्स, -30 ~ -15℃ पर स्टोर करें और बार-बार जमने और पिघलने से बचें;प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर, -30 ~ -15℃ या 2 ~ 8℃ पर स्टोर करें।
प्रयोग प्रक्रिया
नमूना प्रसंस्करण–पौधे का पत्ता
सीधी विधि:युवा पत्तियों का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।एक छोटा और समान नमूना प्राप्त करने के लिए 0.5 - 3 मिमी के निश्चित व्यास के साथ एक छेद पंच का उपयोग करें, और फिर सीधे नमूना को पीसीआर प्रणाली में जोड़ें (50 μl प्रणाली अनुशंसित है)।ध्यान दें, सुनिश्चित करें कि नमूना पीसीआर समाधान में है और ट्यूब की दीवार के खिलाफ नहीं है।यदि प्रत्यक्ष पीसीआर का उपयोग लंबे टुकड़ों और जटिल नमूनों को बढ़ाने के लिए किया जाता है, तो टेम्पलेट के रूप में छोटे व्यास (0.5 - 1 मिमी) वाले नमूने का उपयोग करने से बेहतर परिणाम प्राप्त करने में मदद मिल सकती है।
पीसने की विधि:युवा पत्तियों का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।पत्ती का एक छोटा सा टुकड़ा (लगभग 1 - 3 मिमी व्यास) लें, इसे 20 μl प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर एब में रखें, और जितना संभव हो उतना पीस लें (यह चरण 100 μl पिपेट टिप के साथ पत्ती को निचोड़कर किया जा सकता है) नमूना को मैश करने के लिए)यदि पत्ती ऊतक की बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है (7 मिमी से अधिक नहीं), तो तनुकरण बफर की मात्रा 50 μl तक बढ़ाएँ।पत्तियां पीसने के बाद घोल हरा दिखना चाहिए।एक संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रतिक्रिया टेम्पलेट के रूप में पीसीआर सिस्टम में सतह पर तैरनेवाला का 1 μl जोड़ें।
थर्मल लाइसिस विधि:युवा पत्तियों का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।पत्ती का एक छोटा टुकड़ा (लगभग 1 - 3 मिमी व्यास) लें, इसे 20 μl प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर ए में रखें, और इसे 5 - 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।जिन पत्तियों को लीज करना कठिन है उनके लिए लीसीज समय को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है (20 मिनट से अधिक नहीं)।यदि पत्ती ऊतक की बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है (7 मिमी से अधिक नहीं), तो तनुकरण बफर की मात्रा 50 μl तक बढ़ाएँ।गर्म करने के बाद, संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें, और प्रतिक्रिया टेम्पलेट के रूप में पीसीआर प्रणाली में 1 μl सतह पर तैरनेवाला जोड़ें।
नमूना प्रसंस्करण-पौधे का बीज
पीसने की विधि:5 मिमी व्यास वाले बीजों को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, उन्हें प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर ए के 100 μl में जोड़ें, और एक पिपेट टिप या अन्य उपकरण के साथ नमूना पीस लें।भंवर संक्षेप में और 3 - 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें।सुनिश्चित करें कि बीज का नमूना तनुकरण बफर में डूबा हुआ है।एक संक्षिप्त सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रतिक्रिया टेम्पलेट के रूप में पीसीआर सिस्टम में सतह पर तैरनेवाला का 1 μl जोड़ें।
थर्मल लाइसिस विधि:5 मिमी व्यास वाले बीजों को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, उन्हें प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर ए के 100 μl में जोड़ें, और 5 - 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।जिन पत्तियों को लीज करना कठिन है उनके लिए लीसीज समय को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है (30 मिनट से अधिक नहीं)।गर्म करने के बाद, संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें, और प्रतिक्रिया टेम्पलेट के रूप में पीसीआर प्रणाली में 1 μl सतह पर तैरनेवाला जोड़ें।
एक।उपयुक्त आकार के नमूनों को काटने के लिए कैंची या अन्य उपकरणों का भी उपयोग किया जा सकता है;यदि पंच या कैंची का पुन: उपयोग किया जाता है, तो नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक उपयोग से पहले उन्हें 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान से साफ किया जाना चाहिए।
बी।सुनिश्चित करें कि प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर उपयोग से पहले पूरी तरह से पिघल गया है।यदि बफर चिपचिपा है या उसमें अवक्षेप है, तो उपयोग से पहले इसे पूरी तरह पिघलाने के लिए इसे 37℃ पर गर्म किया जा सकता है।
सी।प्रतिक्रिया प्रणाली में टेम्पलेट की मात्रा को पौधे की सामग्री और मिलाए गए मंदक की मात्रा के अंतर के अनुसार उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है।
प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर
इस उत्पाद में मौजूद प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर ए को अधिकांश पौधों के ऊतकों के जीनोम को मुक्त करने के लिए सख्ती से अनुकूलित किया गया है और यह 4℃ पर कच्चे पौधों के अल्पकालिक भंडारण के लिए उपयुक्त है।यदि नमूने को लंबे समय तक संग्रहीत करने की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, 1 - 2 महीने), तो सतह पर तैरनेवाला को एक नई ईपी ट्यूब में स्थानांतरित करने और इसे -20 ℃ पर संग्रहीत करने की सिफारिश की जाती है।नमूनों को अधिक मजबूती से संग्रहीत करने के लिए, स्थानांतरित सतह पर तैरनेवाला में बराबर मात्रा में प्लांट डायरेक्ट लाइसिस बफर बी जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं और -20℃ पर स्टोर करें।स्थिर भंडारण का समय पौधे के नमूनों और स्थितियों के अनुसार भिन्न होता है।
प्रतिक्रिया प्रणाली
| डीडीएच2O | 20.0 μl तक | 50.0 μl तक |
| 2 × प्लांट डायरेक्ट मास्टर मिक्सa | 10.0 μl | 25.0 µ |
| प्राइमर 1 (10 µM) | 0.8 μl | 2.0 μl |
| प्राइमर 2 (10 µM)b | 0.8 μl | 2.0 μl |
| पौधे की पत्ती/कच्चे अर्क का नमूना(नमूना प्रसंस्करण देखें) | 0.5 - 3 मिमी लीफ डिस्क/एक्स μl | 0.5 - 3 मिमी लीफ डिस्क/एक्स μl |
एक।इसमें एमजी होता है2+2 मिमी की अंतिम सांद्रता पर।
बी।प्रत्येक प्राइमर के लिए 0.4μM की अंतिम सांद्रता का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।प्राइमरों के अत्यधिक उपयोग से गैर-विशिष्ट प्रवर्धन में वृद्धि होगी।
सी।उपयोग किए गए नमूने की मात्रा को वास्तविक स्थिति के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।क्रूड लाइस्ड नमूने की एकल प्रतिक्रिया में उपयोग की जाने वाली मात्रा को प्रतिक्रिया की कुल मात्रा के 2% - 20% के बीच समायोजित किया जा सकता है।बहुत अधिक नमूनों का उपयोग करने से प्रवर्धन विफलता हो सकती है।
प्रतिक्रिया कार्यक्रम
| कदम | तापमान | समय |
| प्रारंभिक विकृतीकरण | 98℃ | 5 मिनट |
| विकृतीकरण | 95℃ | 10 सेकंड |
| एनीलिंग | 58 ~ 72℃ | 15 सेकंड |
| विस्तार | 72℃ | 30 सेकंड |
| अंतिम विस्तार | 72℃ | 5 मिनट |
एक।प्रारंभिक विकृतीकरण (98℃, 5 मिनट) पौधे के ऊतकों के विश्लेषण को बढ़ावा देता है, जीनोमिक डीएनए जारी करता है जिसका उपयोग पीसीआर प्रवर्धन के लिए किया जा सकता है।समय कम न करें या तापमान कम न करें।
बी।इसे प्राइमर टीएम मान के बराबर या टीएम मान से 2 ~ 4℃ अधिक सेट करने की अनुशंसा की जाती है।इस उत्पाद में उपयोग किया जाने वाला प्रत्यक्ष प्रवर्धन डीएनए पोलीमरेज़ पारंपरिक टैक डीएनए पोलीमरेज़ से अलग है, और प्रतिक्रिया एनीलिंग तापमान के लिए विशेष आवश्यकताएं हैं; उच्च एनीलिंग तापमान का उपयोग प्रभावी ढंग से गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को कम कर सकता है और प्रवर्धन दक्षता में सुधार कर सकता है।जटिल टेम्पलेट्स के लिए, एनीलिंग तापमान को समायोजित करके और विस्तार समय को बढ़ाकर कुशल प्रवर्धन प्राप्त किया जा सकता है।
सी।यदि प्रवर्धन उत्पाद की लंबाई ≤1 kb है, तो विस्तार समय 30 सेकंड/kb पर सेट है;यदि प्रवर्धन उत्पाद की लंबाई >1 केबी है, तो विस्तार समय 60 सेकंड/केबी पर सेट है।
डी।जटिल नमूनों या कम प्रवर्धन उपज वाले नमूनों के लिए, चक्रों की संख्या उचित रूप से 40 -50 चक्रों तक बढ़ाई जा सकती है।
अनुप्रयोग
यह पौधों के ऊतकों के प्रत्यक्ष प्रवर्धन और पौधों के नमूनों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए लागू होता है जिनमें पॉलीसेकेराइड और पॉलीफेनोल्स नहीं होते हैं।
टिप्पणियाँ
केवल अनुसंधान के लिए उपयोग करें।नैदानिक प्रक्रियाओं के उपयोग में नहीं।
1. कच्चे पौधे के प्रवर्धन या प्रत्यक्ष प्रवर्धन के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिस्टम, प्राइमर और संचालन सही हैं, प्रयोग शुरू करने से पहले सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शुद्ध जीनोमिक डीएनए का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
2. इस किट में प्रयुक्त प्रत्यक्ष प्रवर्धन डीएनए पोलीमरेज़ में मजबूत प्रूफरीडिंग गतिविधि है।यदि टीए क्लोनिंग करने की आवश्यकता है, तो एडेनिन जोड़ने से पहले डीएनए को शुद्ध करने की सिफारिश की जाती है।
3. प्राइमर डिज़ाइन मार्गदर्शन：
एक।यह अनुशंसा की जाती है कि प्राइमर के 3′ सिरे पर अंतिम आधार G या C होना चाहिए।
बी।प्राइमर के 3′ सिरे पर अंतिम 8 आधारों में लगातार बेमेल से बचा जाना चाहिए।सी।प्राइमर के 3′ सिरे पर हेयरपिन संरचनाओं से बचें।
डी।फॉरवर्ड प्राइमर और रिवर्स प्राइमर के टीएम मान में अंतर 1℃ से अधिक नहीं होना चाहिए और टीएम मान को 60 ~ 72℃ पर समायोजित किया जाना चाहिए (टीएम मान की गणना के लिए प्राइमर प्रीमियर 5 की सिफारिश की जाती है)।
इ।अतिरिक्त अतिरिक्त प्राइमर अनुक्रम जो टेम्पलेट से मेल नहीं खाते हैं, उन्हें प्राइमर टीएम मान की गणना करते समय शामिल नहीं किया जाना चाहिए।
एफ।यह अनुशंसा की जाती है कि प्राइमर की जीसी सामग्री 40% -60% होनी चाहिए।
जी।प्राइमर में ए, जी, सी और टी का समग्र वितरण यथासंभव समान होना चाहिए।उच्च GC या AT सामग्री वाले क्षेत्रों का उपयोग करने से बचें।
एच।प्राइमर के भीतर या दो प्राइमरों के बीच 5 या अधिक आधारों के पूरक अनुक्रमों की उपस्थिति से बचें और दो प्राइमरों के 3′ सिरे पर 3 या अधिक आधारों के पूरक अनुक्रमों की उपस्थिति से बचें।
मैं।गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को रोकने के लिए प्राइमर की विशिष्टता की जांच करने के लिए एनसीबीआई ब्लास्ट फ़ंक्शन का उपयोग करें।
