वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम
वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम एक पुनः संयोजक ई. कोली स्ट्रेन से प्राप्त होता है जो वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम के जीन को वहन करता है।यह एकल एंजाइम दो सबयूनिट (डी1 और डी12) से बना है और इसमें तीन एंजाइमेटिक गतिविधियां हैं (डी1 सबयूनिट द्वारा आरएनए ट्राइफॉस्फेट और गुआनाइलट्रांसफेरेज़ और डी12 सबयूनिट द्वारा ग्वानिन मिथाइलट्रांसफेरेज़)।वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम कैप संरचना के निर्माण को उत्प्रेरित करने के लिए प्रभावी है, जो विशेष रूप से 7-मिथाइलगुआनिलेट कैप संरचना (एम7जीपीपीपी, कैप 0) को आरएनए के 5′ सिरे से जोड़ सकता है।कैप संरचना (कैप 0) यूकेरियोट्स में एमआरएनए स्थिरीकरण, परिवहन और अनुवाद में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया द्वारा आरएनए को कैप करना एक प्रभावी और सरल तरीका है जो इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, ट्रांसफ़ेक्शन और माइक्रोइंजेक्शन के लिए आरएनए की स्थिरता और अनुवाद में काफी सुधार कर सकता है।
अवयव
वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम (10 यू/μL)
10×कैपिंग बफ़र
जमा करने की अवस्था
-25～-15℃ भंडारण के लिए (बार-बार जमने-पिघलने के चक्र से बचें)
भंडारण बफ़र
20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0), 100 एमएम नैसीएल,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% ट्राइटन X- 100, 50% ग्लिसरॉल।
इकाई परिभाषा
वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम की एक इकाई को 37°C पर 1 घंटे में 10pmol GTP को 80nt प्रतिलेख में शामिल करने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है।
गुणवत्ता नियंत्रण
एक्सोन्यूक्लीज़:1μg λ-Hind III के साथ 10U वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम 16 घंटे के लिए 37 ℃ पर डीएनए को पचाता है, जिससे एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित कोई गिरावट नहीं होती है।
एंडोन्यूक्लाइज़:16 घंटे के लिए 37℃ पर 1μg λDNA के साथ वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम के 10U से कोई क्षरण नहीं होता है, जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।
उपनाम:16 घंटे के लिए 37 ℃ पर 1 μg pBR322 के साथ वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम का 10U कोई क्षरण नहीं देता है, जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।
आरएनएसई:37℃ पर 4 घंटे के लिए 1.6μg MS2 RNA के साथ वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम के 10U से कोई क्षरण नहीं होता है, जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।
1.कोलाई डीएनए:ई. कोलाई 16एस आरआरएनए लोकस के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ टैकमैन क्यूपीसीआर का उपयोग करके ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए की उपस्थिति के लिए वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम के 10यू की जांच की जाती है।ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए संदूषण≤1 ई. कोली जीनोम है।
2.जीवाणु एंडोटॉक्सिन: एलएएल-परीक्षण, चीनी फार्माकोपिया IV 2020 संस्करण के अनुसार, जेल सीमा परीक्षण विधि, सामान्य नियम (1143)।बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन सामग्री ≤10 ईयू/मिलीग्राम होनी चाहिए।
प्रतिक्रिया प्रणाली और शर्तें
1. कैपिंग प्रोटोकॉल (प्रतिक्रिया मात्रा: 20 μL)
यह प्रक्रिया 10μg RNA (≥100 nt) की कैपिंग प्रतिक्रिया पर लागू होती है और इसे प्रयोगात्मक मांगों के अनुसार बढ़ाया जा सकता है।
I) 1.5 मिली माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 10μg आरएनए और न्यूक्लिज़-मुक्त H2O को 15.0 µL की अंतिम मात्रा तक मिलाएं।*10×कैपिंग बफर: 0.5एम ट्रिस-एचसीएल, 50 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम डीटीटी, (25℃, पीएच 8.0)
2) 5 मिनट के लिए 65℃ पर गर्म करें और उसके बाद 5 मिनट के लिए बर्फ स्नान करें।
3) निम्नलिखित घटकों को निर्दिष्ट क्रम में जोड़ें
| Cप्रतिद्वंद्वी | Volume |
| विकृत आरएनए (≤10μg, लंबाई≥100 एनटी) | 15 μL |
| 10×कैपिंग बफ़र* | 2 μL |
| जीटीपी (10 एमएम) | 1 μL |
| एसएएम (2 मिमी) | 1 μL |
| वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम (10U/μL) | 1 μL |
*10×कैपिंग बफर：0.5 एम ट्रिस-एचसीएल, 50 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम डीटीटी, (25℃, पीएच8.0)
4) 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, आरएनए अब सीमित है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार है।
2. 5′ टर्मिनल लेबलिंग प्रतिक्रिया (प्रतिक्रिया मात्रा: 20 μL)
यह प्रोटोकॉल 5´ ट्राइफॉस्फेट युक्त आरएनए को लेबल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और इसे मांगों के अनुसार बढ़ाया जा सकता है।लेबल निगमन की दक्षता आरएनए के मोलर अनुपात: जीटीपी, साथ ही आरएनए नमूनों में जीटीपी सामग्री से प्रभावित होगी।
1) 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में उचित मात्रा में आरएनए और न्यूक्लिज़-मुक्त एच2ओ को 14.0 µL की अंतिम मात्रा तक मिलाएं।
2) 5 मिनट के लिए 65℃ पर गर्म करें और उसके बाद 5 मिनट के लिए बर्फ स्नान करें।
3)निम्नलिखित घटकों को निर्दिष्ट क्रम में जोड़ें।
| Cप्रतिद्वंद्वी | Volume |
| विकृत आरएनए | 14 μL |
| 10×कैपिंग बफ़र | 2 μL |
| जीटीपी मिश्रण** | 2 μL |
| एसएएम (2 मिमी) | 1 μL |
| वैक्सीनिया वायरस कैपिंग एंजाइम (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX GTP और कम संख्या में मार्करों को संदर्भित करता है।जीटीपी की सांद्रता के लिए, देखेंनोट 3 के लिए.
4) 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, आरएनए 5' अंत अब लेबल किया गया है और डाउनस्ट्रीम के लिए तैयार है
अनुप्रयोग
1. अनुवाद परीक्षण/इन विट्रो अनुवाद से पहले एमआरएनए कैपिंग
2. एमआरएनए के 5´ सिरे को लेबल करना
उपयोग पर नोट्स
1.वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम के साथ ऊष्मायन से पहले आरएनए के समाधान को गर्म करने से प्रतिलेख के 5´छोर पर द्वितीयक संरचना हट जाती है।ज्ञात उच्च संरचित 5´अंत वाले प्रतिलेखों के लिए समय को 60 मिनट तक बढ़ाएँ।
2. कैपिंग प्रतिक्रियाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएनए को उपयोग से पहले शुद्ध किया जाना चाहिए और न्यूक्लीज मुक्त पानी में निलंबित किया जाना चाहिए।EDTA मौजूद नहीं होना चाहिए और घोल लवण रहित होना चाहिए।
3. 5´ सिरे को लेबल करने के लिए, कुल GTP सांद्रता प्रतिक्रिया में mRNA की मोलर सांद्रता का लगभग 1-3 गुना होनी चाहिए।
4. प्रतिक्रिया प्रणाली की मात्रा को वास्तविक के अनुसार बढ़ाया या घटाया जा सकता है।
