पीएनजीएज़ एफ
पेप्टाइड-एन-ग्लाइकोसिडेज़ एफ (पीएनजीएज़ एफ) ग्लाइकोप्रोटीन से लगभग सभी एन-लिंक्ड ऑलिगोसेकेराइड को हटाने के लिए सबसे प्रभावी एंजाइमैटिक विधि है।पीएनजीएज़ एफ एक एमिडेज़ है, जो एन-लिंक्ड ग्लाइकोप्रोटीन से उच्च मैनोज़, हाइब्रिड और जटिल ऑलिगोसेकेराइड के आंतरिक GlcNAc और शतावरी अवशेषों के बीच टूट जाता है।
आवेदन
यह एंजाइम प्रोटीन से कार्बोहाइड्रेट अवशेषों को हटाने के लिए उपयोगी है।
तैयारी और विशिष्टता
| उपस्थिति | रंगहीन तरल |
| प्रोटीन शुद्धता | ≥95% (एसडीएस-पेज से) |
| गतिविधि | ≥500,000 यू/एमएल |
| Exoglycosidase | किसी गतिविधि का पता नहीं लगाया जा सका (एनडी) |
| एंडोग्लाइकोसिडेज़ F1 | ND |
| एंडोग्लाइकोसिडेज़ F2 | ND |
| एंडोग्लाइकोसिडेज़ F3 | ND |
| एन्डोग्लाइकोसिडेज़ एच | ND |
| प्रोटीज | ND |
गुण
| ईसी नंबर | 3.5.1.52(सूक्ष्मजीव से पुनः संयोजक) |
| आणविक वजन | 35 केडीए (एसडीएस-पेज) |
| समविभव बिंदु | 8. 14 |
| इष्टतम पीएच | 7.0-8.0 |
| इष्टतम तापमान | 65 डिग्री सेल्सियस |
| सब्सट्रेट विशिष्टता | GlcNAc और शतावरी अवशेषों के बीच ग्लाइकोसिडिक बंधनों को तोड़ना चित्र 1 |
| मान्यता स्थल | एन-लिंक्ड ग्लाइकेन जब तक कि इसमें α1-3 फ़्यूकोस न हो चित्र 2 |
| सक्रियकर्ता | डीटीटी |
| अवरोधक | एसडीएस |
| भंडारण तापमान | -25 ~-15 ℃ |
| ताप निष्क्रियता | एक 20µL प्रतिक्रिया मिश्रण जिसमें 1µL PNGase F होता है, को 10 मिनट के लिए 75 °C पर ऊष्मायन द्वारा निष्क्रिय किया जाता है। |
चित्र 1 PNGase F की सब्सट्रेट विशिष्टता
चित्र: 2 पीएनजीएज़ एफ की मान्यता सीटें।
जब आंतरिक GlcNAc अवशेष α1-3 फ़्यूकोस से जुड़े होते हैं, तो PNGase F ग्लाइकोप्रोटीन से N-लिंक्ड ऑलिगोसेकेराइड को अलग नहीं कर सकता है।यह संशोधन पौधों और कुछ कीट ग्लाइकोप्रोटीन में आम है।
Cप्रतिद्वंद्वी
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| अवयव | एकाग्रता |
| 1 | पीएनजीएज़ एफ | 50 μl |
| 2 | 10×ग्लाइकोप्रोटीन डीनेचरिंग बफर | 1000 μl |
| 3 | 10×ग्लाइकोबफर 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% एनपी-40 | 1000 μl |
इकाई परिभाषा
एक इकाई (यू) को 10 µL की कुल प्रतिक्रिया मात्रा में 37°C पर 1 घंटे में 10 µg विकृत RNase B से 95% कार्बोहाइड्रेट को हटाने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है।
प्रतिक्रिया की स्थितियाँ
1. विआयनीकृत पानी के साथ 1-20 माइक्रोग्राम ग्लाइकोप्रोटीन घोलें, 10 माइक्रोएल कुल प्रतिक्रिया मात्रा बनाने के लिए 1 μl 10×ग्लाइकोप्रोटीन डीनेचरिंग बफर और H2O (यदि आवश्यक हो) जोड़ें।
2.100°C पर 10 मिनट तक रखें, बर्फ पर ठंडा करें।
3.2 μl 10×ग्लाइकोबफ़र 2, 2 μl 10% NP-40 डालें और मिलाएँ।
4.1-2 μl PNGase F और H जोड़ें2हे (यदि आवश्यक हो) 20 μl कुल प्रतिक्रिया मात्रा बनाने और मिश्रण करने के लिए।
5.60 मिनट के लिए 37°C पर इनक्यूबेट प्रतिक्रिया।
6.एसडीएस-पेज विश्लेषण या एचपीएलसी विश्लेषण के लिए।
