एमआरएनए कैप2'-ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़

एमआरएनए कैप 2´-ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ एक पुनः संयोजक ई. कोली स्ट्रेन से प्राप्त किया गया था जो वैक्सीनिया एमआरएनए कैप 2 ´-ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ के लिए जीन रखता है।यह एंजाइम आरएनए के 5´छोर पर कैप संरचना से सटे पहले न्यूक्लियोटाइड की 2´-O स्थिति में एक मिथाइल समूह जोड़ता है। एंजाइम कैप्ड आरएनए (कैप) को मिथाइलेट करने के लिए मिथाइल डोनर के रूप में एस-एडेनोसिलमेथिओनिन (एसएएम) का उपयोग करता है। -0) जिसके परिणामस्वरूप एक कैप-1 संरचना बनती है।

Cap1 संरचना अनुवाद दक्षता को बढ़ा सकती है, ट्रांसफ़ेक्शन और माइक्रोइंजेक्शन प्रयोगों में mRNA की अभिव्यक्ति में सुधार कर सकती है। इस एंजाइम को विशेष रूप से सब्सट्रेट के रूप में m7GpppN कैप के साथ RNA की आवश्यकता होती है।यह 5´ छोर पर pN, ppN, pppN या GpppN के साथ RNA का उपयोग नहीं कर सकता है।कैप्ड आरएनए को कैप एनालॉग का उपयोग करके इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से या वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम का उपयोग करके एंजाइमैटिक कैपिंग के माध्यम से तैयार किया जा सकता है।

अवयव

एमआरएनए कैप 2´-ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ (50यू/μL)

10×कैपिंग रिएक्शन बफर

भंडारण

-25 ~- 15℃ भंडारण के लिए (बार-बार जमने-पिघलने के चक्र से बचें)

भंडारण बफ़र

20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0, 25℃), 100 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम डीटीटी, 0. 1 एमएम ईडीटीए, 0. 1% ट्राइटन एक्स- 100, 50% ग्लिसरॉल।

इकाई परिभाषा

एक इकाई को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे में 80 एनटी कैप्ड आरएनए ट्रांसक्रिप्ट के 10 पीएमओल्स को मिथाइलेट करने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है।

गुणवत्ता नियंत्रण परख

एक्सोन्यूक्लिज़:एमआरएनए कैप 2´ -ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ का 50यू 1μg λ-Hind III डाइजेस्ट डीएनए के साथ 37 ℃ पर 16 घंटे के लिए कोई गिरावट नहीं देता है जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।

एन्डोन्यूक्लाइज: 16 घंटे के लिए 37℃ पर 1 μg λDNA के साथ एमआरएनए कैप 2 ´ -ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ का 50 यू कोई गिरावट नहीं देता है जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।

Nickase: 16 घंटे के लिए 37 ℃ पर 1μg pBR322 के साथ mRNA कैप 2 ´ -O-मिथाइलट्रांसफेरेज़ का 50U, एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित अनुसार कोई गिरावट नहीं देता है।

RNase: एमआरएनए कैप 2 ´ -ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ का 50यू 1.6μg एमएस2 आरएनए के साथ 37℃ पर 4 घंटे के लिए कोई गिरावट नहीं देता है जैसा कि एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा निर्धारित किया गया है।

E. कोलाई डीएनए: 50U mRNA कैप 2 ´ -O-मिथाइलट्रांसफेरेज़ की उपस्थिति के लिए जांच की जाती हैE. कोलाई जीनोमिक डीएनए के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ टैकमैन क्यूपीसीआर का उपयोग किया जाता हैE. कोलाई 16एस आरआरएनए लोकस।E. कोलाई जीनोमिक डीएनए संदूषण =1 हैE. कोलाई जीनोम.

जीवाणु अन्तर्जीवविष: एलएएल-परीक्षण, चीनी फार्माकोपिया IV 2020 संस्करण के अनुसार, जेल सीमा परीक्षण विधि, सामान्य नियम (1143)।बैक्टीरियल एंडोटॉक्सिन सामग्री =10 ईयू/मिलीग्राम होनी चाहिए।

प्रतिक्रिया प्रणाली और शर्तें

1. 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में कैप्ड आरएनए और आरएनएएस-मुक्त एच2ओ की उचित मात्रा को 16.0 μL की अंतिम मात्रा में मिलाएं।

2. 5 मिनट के लिए 65℃ पर गर्म करें और उसके बाद 5 मिनट के लिए बर्फ से स्नान करें।

3. निम्नलिखित घटकों को निर्दिष्ट क्रम में जोड़ें (कैप्ड आरएनए के मिथाइलेशन के लिए)।

10 से कम

*10× कैपिंग रिएक्शन बफर: 500 एमएम ट्रिस-एचसीएल(पीएच 8.0, 25℃), 50 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम डीटीटी।

4. 1 घंटे के लिए 37℃ पर इनक्यूबेट करें (200 एनटी से कम लक्ष्य टुकड़े के लिए 2 घंटे इनक्यूबेट की सिफारिश की जाती है)।

अनुप्रयोग

माइक्रोइंजेक्शन और ट्रांसफ़ेक्शन प्रयोगों के दौरान एमआरएनए अभिव्यक्ति में सुधार करना।

उपयोग पर नोट्स

1. प्रतिक्रिया से पहले, आरएनए को शुद्ध किया जाना चाहिए और न्यूक्लीज मुक्त पानी में घोलना चाहिए, सभी समाधानों में कोई ईडीटीए और आयन नहीं होने चाहिए।

2. प्रतिलेख के 5´छोर पर द्वितीयक संरचना को हटाने के लिए प्रतिक्रिया से पहले नमूना आरएनए को 5 मिनट के लिए 65℃ पर गर्म करने की सिफारिश की जाती है।जटिल 5´-टर्मिनल संरचना के लिए इसे 10 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है।