डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा किट

यह किट एक एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) है जो बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन सिस्टम के साथ युग्मित है, जो अनुक्रम की परवाह किए बिना 60 बेस जोड़े (बीपी) से ऊपर की लंबाई के साथ डीएसआरएनए की मात्रात्मक माप के लिए है।प्लेट को एंटी-डीएसआरएनए एंटीबॉडी के साथ पूर्व-लेपित किया गया है।नमूने में मौजूद डीएसआरएनए को जोड़ा जाता है और कुओं पर लेपित एंटीबॉडी से बांध दिया जाता है।और फिर बायोटिनाइलेटेड एंटी-डीएसआरएनए एंटीबॉडी जोड़ा जाता है और नमूने में डीएसआरएनए से जुड़ जाता है।धोने के बाद, एचआरपी-स्ट्रेप्टाविडिन मिलाया जाता है और बायोटिनाइलेटेड एंटी-डीएसआरएनए एंटीबॉडी से जुड़ जाता है।ऊष्मायन के बाद अनबाउंड एचआरपी-स्ट्रेप्टाविडिन को धो दिया जाता है।फिर टीएमबी सब्सट्रेट समाधान जोड़ा जाता है और एचआरपी द्वारा नीले रंग का उत्पाद तैयार करने के लिए उत्प्रेरित किया जाता है जो अम्लीय स्टॉप समाधान जोड़ने के बाद पीले रंग में बदल जाता है।पीले रंग का घनत्व प्लेट में कैद डीएसआरएनए की लक्ष्य मात्रा के समानुपाती होता है।अवशोषण 450 एनएम पर मापा जाता है।

आवेदन

यह किट अवशिष्ट डीएसआरएनए के मात्रात्मक माप के लिए है।

किट घटक

भंडारण और स्थिरता

1. अप्रयुक्त किट के लिए: पूरी किट को शेल्फ जीवन में 2 ~ 8 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है।भंडारण की स्थिरता के लिए तेज़ रोशनी से बचना चाहिए।

2. प्रयुक्त किट के लिए: एक बार माइक्रोप्लेट खुलने के बाद, कृपया अप्रयुक्त कुओं को प्लेट सीलर से ढक दें और डिसीकैंट पैक वाले फ़ॉइल पाउच में वापस आ जाएँ, फ़ॉइल पाउच को ज़िप-सील करें और उपयोग के बाद जितनी जल्दी हो सके 2 ~ 8 ℃ पर वापस आ जाएँ।अन्य अभिकर्मकों को उपयोग के बाद यथाशीघ्र 2~8℃ पर लौटा देना चाहिए।

सामग्री की आवश्यकता है लेकिन आपूर्ति नहीं की गई

1. 450±10nm फिल्टर के साथ माइक्रोप्लेट रीडर (यदि 450 और 650 एनएम तरंग दैर्ध्य पर पता लगाया जा सके तो बेहतर होगा)।

2. माइक्रोप्लेट शेकर.

3. RNase-मुक्त टिप्स और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब।

ऑपरेशन फ़्लोचार्ट

शुरू करने से पहले

1. उपयोग से पहले सभी किट घटकों और नमूनों को कमरे के तापमान (18-25℃) पर लाएँ।यदि किट का उपयोग एक समय में नहीं किया जाएगा, तो कृपया केवल वर्तमान प्रयोग के लिए स्ट्रिप्स और अभिकर्मकों को बाहर निकालें, और शेष स्ट्रिप्स और अभिकर्मकों को आवश्यक स्थिति में छोड़ दें।

2. वॉश बफर: 1× वॉश बफर का 800 एमएल तैयार करने के लिए 20× केंद्रित वॉश बफर के 40 एमएल को 760 एमएल विआयनीकृत या आसुत जल के साथ पतला करें।

3. मानक: उपयोग से पहले स्टॉक समाधान को संक्षेप में स्पिन या सेंट्रीफ्यूज करें।प्रदान किए गए चार मानकों की सांद्रता 5ng/μL है।UTP और pUTP dsRNA मानकों के लिए, कृपया मानक वक्र बनाने के लिए STE बफर के साथ स्टॉक समाधान को 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL तक पतला करें।N1-Me-pUTP dsRNA मानकों के लिए, कृपया मानक वक्र बनाने के लिए STE बफर के साथ स्टॉक समाधान को 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL तक पतला करें।5-ओएमई-यूटीपी डीएसआरएनए मानक के लिए, कृपया मानक वक्र खींचने के लिए स्टॉक समाधान को एसटीई बफर के साथ 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL तक पतला करें।हम अनुशंसा करते हैं कि मानकों को निम्नलिखित चार्ट के रूप में पतला किया जा सकता है:

4. बायोटिनाइलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी और एचआरपी-स्ट्रेप्टाविडिन वर्किंग सॉल्यूशन: उपयोग से पहले स्टॉक सॉल्यूशन को संक्षेप में स्पिन या सेंट्रीफ्यूज करें।उन्हें तनुकरण बफर के साथ कार्यशील सांद्रण तक पतला करें।

5. टीएमबी सबस्टेट: निष्फल युक्तियों के साथ समाधान की आवश्यक खुराक को एस्पिरेट करें और अवशिष्ट समाधान को दोबारा शीशी में न डालें।टीएमबी सबस्टेट प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, टीएमबी सब्सट्रेट को लंबे समय तक प्रकाश में न रखें।

प्रोटोकॉल का उपयोग करना

1. परख के लिए आवश्यक स्ट्रिप्स की संख्या निर्धारित करें।उपयोग के लिए पट्टियों को फ़्रेम में डालें।इस परख में उपयोग नहीं की गई शेष प्लेट स्ट्रिप्स को शोषक के साथ बैग में दोबारा पैक किया जाना चाहिए।प्रशीतित भंडारण के लिए बैग को कसकर बंद करें।

2. मानक, रिक्त और नमूनों में से प्रत्येक के 100μL को उपयुक्त कुओं में जोड़ें।प्लेट सीलर से ढक दें।500 आरपीएम पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।सटीक परख के लिए नमूनों को उचित सांद्रता तक एसटीई बफर के साथ पतला किया जाना चाहिए।

3. धोने का चरण: घोल को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में 250μL वॉश बफर से धोएं और इसे 30 सेकंड तक खड़े रहने दें।प्लेट को अवशोषक कागज पर रखकर वॉश बफर को पूरी तरह से हटा दें।पूरी तरह से 4 बार धोएं.

4. प्रत्येक कुएं में 100μL बायोटिनाइलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी वर्किंग सॉल्यूशन डालें।प्लेट सीलर से ढक दें।500 आरपीएम पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

5. धोने का चरण दोहराएँ।

6. प्रत्येक कुएं में 100μL एचआरपी-स्ट्रेप्टाविडिन कार्यशील घोल डालें।प्लेट सीलर से ढक दें।500 आरपीएम पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक सेते रहें।

7. धोने के चरण को दोबारा दोहराएं।

8. प्रत्येक कुएं में 100μL TMB सब्सट्रेट घोल डालें।प्लेट सीलर से ढक दें।आरटी पर 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें, प्रकाश से बचाएं।सब्सट्रेट घोल मिलाने से तरल नीला हो जाएगा।

9. प्रत्येक कुएं में 50μL स्टॉप सॉल्यूशन डालें।स्टॉप सॉल्यूशन मिलाने से तरल पीला हो जाएगा।फिर माइक्रोप्लेट रीडर चलाएं और तुरंत 450nm पर माप करें।

परिणामों की गणना

1. प्रत्येक मानक, नियंत्रण और नमूने के लिए डुप्लिकेट रीडिंग का औसत निकालें और औसत शून्य मानक ऑप्टिकल घनत्व घटाएं।ऊर्ध्वाधर (Y) अक्ष पर अवशोषण और क्षैतिज (X) अक्ष पर dsRNA सांद्रता के साथ एक मानक वक्र का निर्माण करें।

2. 5 या 4 पैरामीटर गैर-रेखीय फिट मॉडल में कंप्यूटर-आधारित कर्व-फिटिंग सॉफ़्टवेयर जैसे कर्व विशेषज्ञ 1.3 या एलिसा कैल्क के साथ गणना करने की अनुशंसा की जाती है।

प्रदर्शन

1. संवेदनशीलता:

पता लगाने की निचली सीमा: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA के लिए), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA के लिए)।

मात्रा की निचली सीमा: 0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA के लिए), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA के लिए), 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA के लिए)।

2. परिशुद्धता: इंट्रा-परख का सीवी ≤10%, अंतर-परख का सीवी ≤10%

3. रिकवरी:80%~120%

4.रैखिकता: 0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA के लिए)।

विचार

1. टीएमबी प्रतिक्रिया तापमान और समय महत्वपूर्ण है, कृपया निर्देश के अनुसार उन्हें सख्ती से नियंत्रित करें।

2. अच्छी परख प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता और संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए, अतिरिक्त अप्रयुक्त अभिकर्मकों को हटाने के लिए प्लेटों की उचित धुलाई आवश्यक है।

3. उपयोग से पहले सभी अभिकर्मकों को अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए और नमूना या अभिकर्मकों को जोड़ने के दौरान गड़बड़ी से बचना चाहिए।

4. यदि सांद्रित वॉश बफर (20x) में क्रिस्टल बन गए हैं, तो 37℃ तक गर्म करें और धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि क्रिस्टल पूरी तरह से घुल न जाएं।

5. सोडियम एज़ाइड (NaN3) युक्त नमूनों की परख से बचें, क्योंकि यह HRP गतिविधि को नष्ट कर सकता है जिसके परिणामस्वरूप dsRNA की मात्रा कम आंकी जा सकती है।

6. परख के दौरान RNase संदूषण से बचें।

7. मानक/नमूना, डिटेक्शन एंटीबॉडी और एसए-एचआरपी को आरटी पर बिना हिलाए भी आयोजित किया जा सकता है, लेकिन इससे डिटेक्शन संवेदनशीलता एक गुना कम हो सकती है।इस मामले के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि UTP और pUTP dsRNA मानकों को 2pg/μL से पतला किया जाना चाहिए, N1-Me-pUTP dsRNA मानकों को 4pg/μL से पतला किया जाना चाहिए और 5-OMe-UTP dsRNA मानक को 8pg/μL से पतला किया जाना चाहिए।इसके अलावा, कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए एचआरपी-स्ट्रेप्टाविडिन वर्किंग सॉल्यूशन को इनक्यूबेट करें।फ्लास्क शेकर का उपयोग न करें, क्योंकि फ्लास्क शेकर का परिणाम गलत हो सकता है।

विशिष्ट परिणाम

1. मानक वक्र डेटा

2. मानक वक्र गणना

3. लाइनर डिटेक्शन रेंज: 0.0312- 1pg/μL